Вирусная нагрузка и ПЦР – почему их нельзя использовать для подтверждения ВИЧ-инфекции

Кристин Джонсон, Continuum.

«Биотехнологическая версия аппарата Xerox» – так журнал Forbes назвал полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Этот революционный метод позволяет учёному взять образец, содержащий небольшое количество ДНК, и воспроизвести эту последовательность ДНК, пока не будет миллион копий вместо одной или двух.

Кэри Маллис, изобретатель ПЦР, получил Нобелевскую премию 1993 года за свое изобретение на миллиард долларов, которое стало незаменимым для любой генетической лаборатории. Парадоксально, что одним из первых применений ПЦР было обнаружение ВИЧ, учитывая, что сам Маллис не верит, что его изобретение способно на это. Маллис заявляет, что проблема заключается в том, что ПЦР слишком эффективна – она ​​усиливает любую ДНК в образце, независимо от того, принадлежит ли эта ДНК ВИЧ или контаминанту. И как решить, какая часть амплифицированного материала может быть ВИЧ, а какая – контаминантом (ами), если вы не смогли обнаружить ВИЧ в образце без использования ПЦР?

Один из основных аргументов против гипотезы ВИЧ / СПИДа заключается в том, что при использовании традиционных методов обнаружения вирус ВИЧ никогда не выявлялся в значительных количествах у людей со СПИДом. Например, вирусная культура оказалась достаточной для обнаружения других вирусов, но не ВИЧ. Почему нет? Когда вирусная культура используется для обнаружения ВИЧ, ВИЧ никогда не обнаруживают и даже не ищут в культурах. Его присутствие измеряется очень косвенными методами: анализами на обнаружение обратной транскриптазы или белка p24, ни один из которых не является специфичным для ВИЧ. Косвенные методы не потребовались бы, если бы изначально было значительное количество ВИЧ.

Другими словами, если присутствует значительное количество ВИЧ, проверенные временем лабораторные методы должны быть в состоянии его обнаружить. Они это сделать не могут. Теперь нам нужна не только ПЦР, но и постоянные модификации и улучшения ПЦР, чтобы попытаться найти ВИЧ.

Так родилась идея «вирусной нагрузки», вдохновленная двумя потоками научных работ, в которых утверждалось, что ВИЧ активно тиражируется миллиардами: изначально статьи утверждали, что ВИЧ «прячется в лимфатических узлах» (1,2) и совсем недавно были опубликованы статьи Хо и Вей. (3,4) В последних исследованиях предпринималась попытка измерить «вирусную нагрузку» в заданный момент, после чего пациенту вводили «противовирусные» препараты. Предполагалось, что лекарства предотвратят репликацию любого нового ВИЧ, и вирусная нагрузка соответственно снизится. Однако в течение нескольких дней оставшийся вирус мутирует в форму, устойчивую к лекарствам, и через несколько недель вирусная нагрузка вернется к уровням до лечения. Применив математическую формулу к этой динамике, якобы была определена скорость репликации вируса.

Так родилось то, что я называю «теорией кухонной мойки доктора Хо». По словам Хо, каждый день создаются миллиарды копий ВИЧ, которые заражают миллиарды Т4-клеток. Эти Т-клетки разрушаются не ВИЧ, а иммунной системой. Они пополняются каждый день, но с годами иммунная система теряет свои позиции, и ВИЧ, наконец, побеждает. Этот процесс можно сравнить с раковиной с открытым сливом, когда вода льется из-под крана (создаются новые Т-клетки) с несколько меньшей скоростью, чем утекают (инфицированные Т-клетки разрушаются).

Очень важно отметить, что все исследования вирусной нагрузки полностью полагаются на ПЦР и связанные с ней методы. Эта статья дискредитирует ПЦР как точный метод определения ВИЧ-инфекции, что, в свою очередь, поставит под сомнение любые выводы о ВИЧ, сделанные на основе методов ПЦР.

Некоторые основы ДНК

ПЦР использует некоторые фундаментальные свойства ДНК. ДНК (как и РНК) представляет собой нуклеиновую кислоту, а нуклеиновые кислоты состоят из нуклеотидных «строительных блоков». ДНК существует в виде двух комплементарных цепей, образующих двойную спираль (две переплетающиеся спирали). Эти нити состоят из множества нуклеотидов, соединенных вместе, чтобы образовать длинную цепь ДНК.

Молекула нуклеотида состоит из трех разных частей: фосфата и сахара (которые образуют основу или ленточную структуру) и основания. Существует четыре типа оснований: A, T, C и G (аденин, тимин, цитозин и гуанин). Эти основания прикреплены к позвоночнику, который замотан знакомой двойной спиралью.

Основания на одной цепи связываются с основаниями на другой цепи, и это придает ДНК стабильную структуру двойной спирали. (Представьте, что две нити образуют застежку-молнию.) Отличительная природа кода ДНК организма зависит от порядка или последовательности оснований в цепи ДНК.

Существуют особые правила о том, как основания образуют химические связи с другими основаниями: A будет связываться только с T, а C будет связываться только с G. Основание одной цепи, связывающееся с основанием на другой цепи, называется “дополнительная пара оснований”. Это правило комплементарного спаривания оснований дает ДНК способность точно воспроизводить себя.

Каждый раз, когда клетка делится, она должна делать копию своей ДНК для новой клетки. Двухцепочечная ДНК сначала «расстегивается» на две отдельные цепи. Каждая отдельная нить служит шаблоном или узором, из которого можно сделать новую копию своей дополнительной нити. (Таким образом, цепь №1 служит шаблоном для создания новой копии цепи №2, и наоборот.) Затем отдельная цепь включает новые строительные блоки нуклеотидов из окружающей среды в соответствии с правилом комплементарного спаривания оснований. Другими словами, доступный A на одной цепи захватит нуклеотид T, C захватит G и так далее, пока вся противоположная цепь не будет продублирована. В конце этого процесса две исходные нити снова застегиваются, и две скопированные нити служат ДНК для новой клетки.

Как работает ПЦР

Теория ВИЧ гласит, что он, как и другие предлагаемые ретровирусы, содержит РНК, но не содержит ДНК: когда говорят, что ВИЧ заражает клетку, считается, что фермент обратной транскриптазы превращает РНК в комплементарную ДНК, которая затем вставляется в ДНК клетки-хозяина.

Следовательно, если ПЦР используется для анализа тканей человека на наличие ВИЧ, она будет искать только короткий сегмент из всей цепи клеточной ДНК. Этот короткий сегмент представляет собой генетический материал, предложенный для ВИЧ, который теоретически включен в ДНК клетки. (Исследования вирусной нагрузки пытаются найти бесклеточный ВИЧ. Даже здесь ПЦР ищет только часть всего предложенного генетического пакета или генома HlV, а не весь вирус).

ПЦР работает следующим образом

• Шаг 1: Нагрейте шаблон. Длинный кусок ДНК, содержащий копируемый меньший фрагмент, нагревается. Две нити можно «расплавить» при повышенных температурах, и они будут медленно возвращаться в исходное состояние вместе при охлаждении. Две отдельные цепи дополняют друг друга. Они служат шаблонами для новых цепей.
• Шаг 2: Добавьте грунтовки. Что-то, называемое грунтовкой, необходимо для следующего шага. Праймеры – это нуклеотиды, которые образуют короткую последовательность новой цепи. Праймеры конструируются так, чтобы быть комплементарными известной последовательности, которая является частью более крупной последовательности, и, таким образом, известно, где праймеры будут связываться (или гибридизоваться).
  
  Праймеры прикрепляются к каждому концу сегмента ДНК, который должен быть скопирован (сегмент, который представляет предполагаемый генетический материал ВИЧ). Праймеры служат двум целям: а) пометить каждый конец целевого сегмента, чтобы амплифицировался только этот сегмент, а не вся цепь, и б) запустить процесс дупликации. Новые нити строятся блок за блоком под действием фермента, называемого полимеразой. Полимераза строит новую цепь ДНК рядом с существующей цепью. Полимераза не будет работать, если на старой цепи (матрице) уже нет нескольких нуклеотидов, образующих короткую последовательность новой цепи (праймера). (Если вы когда-нибудь встретите ссылку на «шаблонные праймеры», они говорят именно об этом.)
  
  Другими словами, полимераза может образовывать новую цепь только в том случае, если новая цепь уже частично сформирована. В природе, когда ваша собственная ДНК дублируется, другие ферменты, называемые ДНК-примазами, создают праймер на старой цепи.
  
  Как только полимераза начинает работать, она ползет по единственной нити ДНК (матрице), добавляя к ней один за другим нуклеотидные строительные блоки. Праймер становится частью только что созданной нити.
  
  В природе полимеразы разъединяют цепи ДНК, в то время как они создают новую цепь ДНК. Так создаются дублированные копии ДНК, чтобы клетки, такие как клетки крови и кожи, могли делиться на две новые клетки, что необходимо для жизни.
• Шаг 3: Усиление. И снова после плавления и последующего отжига праймеров фермент полимераза копирует ДНК, начиная с праймера, создавая новую копию каждого целевого сегмента. Этот процесс повторяется до 30-40 раундов. В течение каждого цикла количество сегментов удваивается, поэтому два сегмента становятся четырьмя, четыре – восемью, затем 16 и т. Д. К концу процесса было сделано примерно миллион копий исходного сегмента. Теперь у вас очень много ДНК, тогда как изначально у вас было лишь крохотное количество. Вот почему ПЦР имеет способность найти «иголку в стоге сена».

Очевидно, что праймеры должны быть специфичными для ВИЧ. Будет ли в результате ПЦР получен амплифицированный продукт («положительный результат ПЦР»), зависит от того, совпадают ли добавляемые вами праймеры с частью ДНК в целевом образце.

Ниже мы увидим, что специфичность праймеров для ВИЧ вызывает сомнения. Даже если праймеры были специфичными для ВИЧ, если в мишени присутствуют аналогичные последовательности, праймеры в слабых условиях будут формировать гибриды с (или связывать) родственные последовательности, которые не полностью совпадают. Затем они примут полимеразу, которая запустит процедуру амплификации, даже если изначально ВИЧ не присутствовал.

Использование ПЦР для поиска ВИЧ

Проблема для гипотезы о ВИЧ заключалась в том, что даже при использовании стандартной ПЦР исследователи не могли обнаружить много ВИЧ у людей с диагнозом СПИД. Чтобы разрешить этот парадокс, авторы новых статей о «вирусной нагрузке» придумали две модификации ПЦР, которые, как они утверждали, были гораздо более эффективными при обнаружении ВИЧ. Это были QC-PCR и тест разветвленной ДНК (bDNA). И вдруг – эврика! – были обнаружены миллиарды копий того, что считалось ВИЧ. Противоречие здесь, кажется, ускользнуло от авторов этих статей: зачем вообще нужны такие мощные новые тесты, чтобы найти микроб, который присутствует в миллиардах? Традиционных методов должно хватить.

QC-PCR

Это тест, использованный в вышеупомянутых статьях Энтони Фаучи (Панталео) и Эшли Хаас (Эмбретсон), в которых утверждалось, что ВИЧ «скрывается в лимфатических узлах». Эти документы были приняты как факт, хотя метод QC-PCR был и остается непроверенным.

Марк Крэддок из Сиднейского университета (Австралия) объяснил принципы и проблемы QC-PCR следующим образом: (8)

«Масса ПЦР производит фрагменты ДНК. Вы начинаете с небольшого количества ДНК, и после каждого цикла ПЦР количество имеющейся у вас ДНК составляет от одного до двух раз больше, чем в начале цикла. Таким образом, количество ДНК, которое вы имеете для изучения возрастает экспоненциально. Тот факт, что ПЦР – это экспоненциальный процесс роста, означает, что экспериментальные ошибки также будут расти экспоненциально, поэтому вам нужно быть очень осторожным в том, что вы делаете с этим процессом”.

«Ряд людей решили, что можно оценить количество ДНК, присутствующей в образце, с помощью ПЦР. Это так называемая количественная конкурентная ПЦР. Идея состоит в том, чтобы добавить к образцу для оценки известное количество похожей, но различимой ДНК, и амплифицировать оба вместе. Предполагается, что относительные количества двух продуктов должны оставаться одинаковыми, и, следовательно, вы можете рассчитать размер образца, с которого вы начали, зная соотношение двух, определяемое наблюдение, когда ПЦР произвела достаточно обоих для измерения, и сколько было добавлено контрольной ДНК.

«Что абсолютно важно, так это то, что относительные количества тестируемой ДНК и вашего известного контролируемого вещества должны оставаться в точности равными. Размытость – недостаточно хороша. Малейшие отклонения будут увеличиваться в геометрической прогрессии и могут привести к огромным ошибкам в вашей оценке”.

«На трудности количественного использования ПЦР указал Люк Реймекерс в журнале Analytical Biochemistry в 1993 году. Он отметил, что опубликованные статьи по QC-PCR содержат данные, которые показывают, что фундаментальное предположение о том, что относительные размеры образцов остаются постоянными, не выполняется. Несмотря на это, исследователи ВИЧ продолжают использовать ПЦР для количественной оценки вирусной нагрузки. Просто невозможно узнать, верна ли данная оценка или она в 100 000 раз завышена! »

Тодд Миллер называет QC-PCR «последней модой в науке» и соглашается с тем, что, если относительные количества вашей тестовой ДНК и вашего известного контролируемого вещества не равны, вы не можете сказать ничего об оценке этой работы (количество предполагаемой РНК ВИЧ в образце крови пациента).

Каким образом QC-PCR со всеми ее недостатками стала приемлемым тестом на ВИЧ? 

Миллер объясняет: «В современной науке эта ситуация проявляется следующим образом: сначала некоторые люди тратят много времени, пытаясь заставить этот тест работать, и, если им повезет, в конечном итоге публикуют статьи с оговорками в процедуре. Во-вторых, другим случается, что тест дает им ответ, который “имеет смысл”, и публикуют их данные как значительный вклад в эту область. В-третьих, из-за своей относительной новизны и загадочного характера он остается почти приемлемым для многих. Однако большинство из тех, кто его использует, больше заинтересованы в значимости результатов, чем в механике реакции».

бДНК – ПЦР с разветвленной ДНК

Это тест, использованный в статье Хо. Хотя, строго говоря, это не ПЦР, но он упоминается как таковой, поскольку включает в себя технологию типа ПЦР. Разница в том, что бДНК усиливает сигнал, а не цель. То есть обычная ПЦР делает больше мишеней, чтобы вы могли ее найти, тогда как бДНК как бы освещает ее ярким светом, чтобы вы могли ее лучше видеть. Project Inform любезно прислал мне следующее объяснение того, как работает bDNA: (9)

“Копии ДНК-зонда прикрепляются к стенке небольшого лабораторного сосуда; затем образец помещается внутрь. [ДНК-зонд – это небольшой фрагмент ДНК, комплементарный целевой последовательности ДНК.] Этот зонд связывается с определенной частью РНК ВИЧ, если она обнаружена в образце, удерживающая РНК в сосуде. Затем вставляется другой зонд ДНК; один конец этого присоединяется к другой части РНК ВИЧ. Другой конец второго зонда имеет много ответвлений и каждая ветвь заканчивается химическим веществом-репортером, которое при определенных условиях будет производить свет, который может быть обнаружен с помощью лабораторного оборудования. Каждая молекула РНК ВИЧ может присоединяться к одной из этих разветвленных структур и удерживать небольшое количество источников света – а не только одна. Таким образом, очень небольшие количества целевой РНК могут быть обнаружены без необходимости амплификации ПЦР».

В своей первоначальной статье Хо не привел данных о протоколах этого теста и его надежности. Читателя отсылали к двум другим газетам, находившимся «в печати». Таким образом, в то время не было данных ни у кого, кто хотел бы проверить этот метод. Данные, полученные с помощью бДНК, были подтверждены с помощью QC-PCR, детали QC-PCR изложены в справочнике, написанном четырьмя соавторами исследования Wei, вряд ли то, что вы могли бы назвать независимыми или объективными исследователями. В традициях исследований ВИЧ недоказанные теории и ошибочные исследования безоговорочно принимаются и включаются в «общепринятое мнение» до того, как будут должным образом подтверждены. К тому времени ущерб уже нанесен, и если последующие недостатки будут обнаружены, это вряд ли имеет значение.

Механика bDNA сложна: происходит пять различных реакций гибридизации. Гибридизация – это стандартный метод, при котором ДНК-зонд помещается в образец и связывается с любыми комплементарными сегментами, которые он находит. Это еще один косвенный тест, и в нем много проблем. 

По словам молекулярного биолога Брайана Эллисона, «молекулярная биология сработает только в том случае, если вы сначала очистите вещество. Всегда есть возможность перекрестных реакций, особенно когда вы помещаете свои зонды в большой суп из белков» (чем и является наша кровь).

Дюсберг указал на следующее: после внесения соответствующих корректировок в свои расчеты, сам Хо позже обнаружил, что более 10 000 вирусов, выведенных с помощью анализа bDNA, использованного в его статье Nature, на самом деле соответствуют менее чем одному инфекционному вирусу, что заставляет задуматься о том, что это такое. Это то, что на самом деле измеряется этими тестами. (10) Тем не менее, эти умозрительные и непроверенные документы были приняты как евангельская истина!

По мнению Эллисона, исследование Хо – это «Чистая фантазия. Никогда не было статьи, показывающей вирусную нагрузку».

Проблемы с ПЦР

1. Точность ПЦР никогда не проверялась надлежащим золотом стандартом

Чтобы узнать, действительно ли работает какой-либо диагностический тест на ВИЧ-инфекцию, необходимо подтвердить его независимым золотым стандартом. Единственным подходящим золотым стандартом для этой цели является сам ВИЧ. Другими словами, результаты вашего экспериментального теста, будь то ПЦР или что-то еще, необходимо сравнить с результатами выделения вируса в каждом тестируемом образце. Если вирус действительно обнаружен у каждого пациента с положительной ПЦР, а вирус не обнаружен у каждого пациента с отрицательной ПЦР, то можно сказать, что ПЦР чрезвычайно точна для обнаружения ВИЧ.

Концепция выделения вируса как золотого стандарта особенно важна в случае ВИЧ, поскольку ВИЧ чрезвычайно трудно выделить, если вообще возможно – и дать определение в генетических или молекулярных терминах. Даже если кому-либо и удавалось изолировать вирус ВИЧ (11), он никогда не использовался в качестве золотого стандарта для любого диагностического теста на ВИЧ, включая ПЦР. В настоящее время bDNA использует QC-PCR как золотой стандарт; QC-PCR использует регулярную ПЦР как золотой стандарт; Обычная ПЦР использует тесты на антитела как золотой стандарт, а тесты на антитела используют друг друга. Время от времени я замечал, что исследователи, которые «подтверждают» тест на антитела к ВИЧ, неизменно заявляют, что они оценивали эффективность своего теста на образцах, которые, как известно, были ИСТИННО-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМИ или ИСТИННО-ОТРИЦАТЕЛЬНЫМИ. Откуда они это узнали? Все просто: без золотого стандарта.

Иногда утверждают, что «исследования показали», что эти тесты согласуются друг с другом или подтверждают выводы друг друга, и поэтому они должны быть правильными. Это не строго научное мышление. Иногда результаты разных тестов могут совпадать друг с другом, но это ничего не доказывает – не больше, чем если бы пять преступников согласились, что они были где-то в другом месте во время ограбления банка.

Элеопулос говорит о важности золотых стандартов:

«Использование вирусной изоляции в качестве независимого средства установления наличия или отсутствия вируса технически известно как золотой стандарт и является наиболее важным элементом для аутентификации любого диагностического теста. Без золотого стандарта исследователь безнадежно дезориентирован, поскольку у него нет автономных критериев, по которым он мог бы оценить тест, который он стремится разработать … Только таким образом мы можем убедить пациентов, что положительный результат ПЦР на ВИЧ является положительным».

Даже известный исследователь СПИДа Уильям Блаттнер признал, что «одной из трудностей при оценке специфичности и чувствительности тестов на человеческий ретровирус (включая ВИЧ) является отсутствие окончательного «золотого стандарта». В отсутствие золотых стандартов как для HTLV-1, так и для ВИЧ-1 истинная чувствительность и специфичность для обнаружения вирусных антител и остаются неточными». (12)

Марк Крэддок заявляет, что КК-ПЦР непроверена и, вероятно, не поддается проверке. Он спрашивает: «Если ПЦР – единственный способ обнаружения вируса, то как установить точную вирусную нагрузку независимо от ПЦР, чтобы вы могли быть уверены, что цифры, которые дает ПЦР, верны?» Все это, по-видимому, было упущено исследователями СПИДа, поскольку регулярно рекомендуется использовать ПЦР, особенно QC-PCR, в качестве золотого стандарта для других тестов на ВИЧ. (9,13)

2. Специфичность ПЦР никогда не была определена

Специфичность означает, как часто тест будет давать отрицательные результаты у людей, которые не инфицированы. Рейтинг специфичности теста показывает уровень ложноположительных результатов, которых следует ожидать при использовании этого теста. Без золотого стандарта изоляции вирусов истинная специфичность никогда не будет известна. Даже при использовании согласования с тестами на антитела в качестве золотого стандарта ПЦР не оказалась очень специфичной для ВИЧ. (6)

Ссылаясь на исследование квалификации, в котором участвовали пять лабораторий с обширным опытом ПЦР, Слоанд утверждает, что средняя специфичность составила 94,7%. (14) Специфичность составила 90%. Цифры 90-х могут звучать неплохо, но на самом деле это не так. Количество ложноположительных результатов по сравнению с истинно положительными зависит от распространенности ВИЧ-инфекции в любой тестируемой популяции (15) – чем ниже распространенность, тем больше ложноположительных результатов.

Слоанд отмечает, что если бы уровни специфичности, достигнутые в этом исследовании, были применены к потенциальной популяции доноров крови “(доноры крови теперь состоят из представителей общей популяции с низкой распространенностью), то” … на каждую обнаруженную истинно скрытую инфекцию приходилось 1800 неинфицированных. Доноры будут классифицированы как положительные по ПЦР, а 3500 – как неопределенные по результатам ПЦР. Таким образом, ПЦР явно не подходит для общего скрининга перелитой крови и, следовательно, для любой популяции с низкой распространенностью. При специфичности 90% я бы сказал, что она не подходит для тестирования любой популяции.

В факсе, который я получил от Центров по контролю за заболеваниями (CDC) в 1994 году относительно ПЦР, они заявили, что «ни его специфичность, ни его чувствительность не известны» и что «ПЦР не рекомендуется и не лицензирована для повседневных диагностических целей». (16)

Вкратце: «Специфичность любой формы ПЦР для генома ВИЧ не определена». (5)

3. Праймеры для ПЦР не специальные

Согласно Элеопулосу, Тернеру и Пападимитриу, «минимальное требование для [интерпретации того, что положительный сигнал ПЦР или гибридизация в целом доказывает наличие ВИЧ-инфекции], является предварительным доказательством того, что праймеры для ПЦР и зонды гибридизации принадлежат уникальному ретровирусу, ВИЧ, и что реакции ПЦР и гибридизации являются ВИЧ-специфическими. Тернер сказал мне: «Аргументы ПЦР в отношении генома требуют выделения ВИЧ как абсолютно необходимого. Иначе как кто-нибудь узнает происхождение нуклеиновой кислоты?»

Элеопулос оспаривает реальность отдельного генома ВИЧ. Признавая ее существование ради аргумента, она предлагает следующие доказательства, демонстрирующие неспецифичность ПЦР для ВИЧ: (17)

• Невозможно быть уверенным, что зонды нуклеиновой кислоты «ВИЧ» и праймеры для ПЦР специфичны для ВИЧ, потому что большинство, если не все, зонды, используемые для анализов гибридизации, включая зонды и праймеры для ПЦР, получены из выращенных на «ВИЧ» в тканевых культурах с использованием клеток (называемых клеточной линией), взятых у пациента с лейкемией клеток Т4, заболеванием, которое, как утверждает Галло, вызывается ретровирусом, похожим на ВИЧ – HTLV-I. А недавно утверждалось, что ретровирус был выделен из культуры клеток, не инфицированных ВИЧ, с использованием другой линии клеток. Таким образом, было показано, что стандартные клеточные линии, используемые для выращивания ВИЧ, указывают на другие ретровирусы. Поскольку даже хорошо зарекомендовавший себя метод выделения ретровирусов (который на сегодняшний день никогда не применялся для ВИЧ) не может отличить один ретровирус от другого, нельзя быть уверенным в том, что это «ВИЧ».
• Предлагаемые гены ВИЧ гибридизуются со структурными генами HTLV-I и HTLV-II, двух других человеческих ретровирусов. Это означает, что если зонды обнаружат генетический материал от этих других ретровирусов, они будут его придерживаться и вместо этого подадут сигнал о том, что они обнаружили ВИЧ. Поскольку принято считать, что 10% пациентов с диагнозом СПИД являются носителями HTLV-I и что нормальный геном человека содержит последовательности, относящиеся к HTLV-I и HTLV-II, можно ожидать такого типа перекрестной реакции.
• Нормальные клетки человека содержат сотни или тысячи последовательностей, подобных ретровирусу, то есть небольшие участки ДНК, которые соответствуют небольшой части предполагаемого генома ВИЧ или других ретровирусов. И поскольку ПЦР часто усиливает лишь небольшую часть всего генома того, что она ищет, откуда вы знаете, что то, что она обнаруживает, не является нормальной последовательностью клеточного гена, которая просто случайно совпадает с частью того, что предлагается для ВИЧ?
• Дополнительным доказательством неспецифичности ПЦР является то, что положительные ПЦР могут быть получены из клеток без нуклеиновых кислот. Итак, если нет нуклеиновой кислоты, нет ни ДНК, ни РНК, а если нет ДНК или РНК, то определенно нет ВИЧ.
• Химические вещества, используемые в лабораториях при подготовке культур тканей (называемые буферами и реагентами), могут давать положительные сигналы ПЦР на ВИЧ. (18)

4. ПЦР обнаруживает только маленький фрагмент всего вируса

ПЦР выявляет в лучшем случае отдельные гены, а чаще всего – только части генов. Если ПЦР обнаруживает два или три генетических фрагмента из возможной дюжины полных генов, это не доказывает, что все гены (весь геном) присутствуют. Часть гена не равна полной вирусной частице.

Специалисты по ВИЧ признают, что большинство предлагаемых геномов ВИЧ являются неполными; они никогда не могли организовать синтез вирусной частицы.

Тернер объясняет: «Даже если бы все геномы были полными, наличие планов не означает, что вы построили дом. Вы можете носить весь ретровирусный геном внутри своих клеток всю жизнь, даже не создавая вирусных частиц». Эти две проблемы делают еще более неопределенным, каково значение положительной ПЦР.

5. Обнаружение «РНК ВИЧ» по ПЦР не ЗНАЧИТ присутствие ВИЧ

В наши дни я не устаю слышать фразу «ПЦР РНК ВИЧ». В чем разница между этой и обычной старой ПЦР ДНК? Регулярная ПЦР ищет версию ДНК того, что часто считается геномом ВИЧ; РНК-ПЦР ищет версию РНК, то есть свободный вирус, который не заразил клетку.

С новым представлением о том, что ВИЧ активно размножается миллиардами, теперь стало необходимым определить, сколько свободного вируса может быть в любой момент времени. Свободный вирус будет содержать только РНК, поэтому, если ПЦР обнаружит много «РНК ВИЧ», считается, что миллиарды копий свободного вируса роятся вокруг тканей пациента. Другими словами, если вы обнаружите РНК, вы тоже нашли ВИЧ. Поскольку считается, что ВИЧ содержит две цепи РНК, предлагаемая формула такова: Две РНК = один вирус.

На самом деле все не так просто. В 1993 году, во время фазы теории вирусной нагрузки «ВИЧ скрывается в лимфатических узлах», Пиатак и его коллеги, включая Шоу, признали, что для определения количества частиц ВИЧ необходимо иметь предварительные доказательства того, что РНК действительно принадлежит к частице ВИЧ. (5) Таких доказательств представлено не было. Пока не установлено никакой взаимосвязи между количеством РНК и количеством частиц, которые могут присутствовать или не присутствовать. И никто не установил, происходит ли РНК от вирусной частицы или откуда-то еще. Как узнать происхождение нуклеиновой кислоты (РНК) без выделения вируса?

6. Бесклеточный вирус не является инфекционным вирусом

Даже если бы Хо был прав в отношении миллиардов бесклеточных ВИЧ, присутствующих в кровотоке, свободный вирус по определению не является инфекционным вирусом; он не имеет значения как возбудитель. Чтобы ВИЧ заразил клетку, его белок оболочки, gp120, должен связываться с участком рецептора CD4 на поверхности клетки. Однако еще в 1983 году Галло указал, что «вирусная оболочка, необходимая для инфекционности, очень хрупкая. Она имеет тенденцию отрываться, когда вирус отрывается от инфицированных клеток, что делает частицы неспособными инфицировать новые клетки». Из-за этого Галло сказал, что «может потребоваться межклеточный контакт» для ретровирусной инфекции. Поскольку gp120 «имеет решающее значение для способности вируса гепатита V инфицировать новые клетки» и поскольку gp120 не обнаруживается в бесклеточных частицах, даже если в крови присутствует огромное количество свободного ВИЧ, они не заразны. (17)

7. ПЦР тест не является стандартизированным или воспроизводимым

В недавней статье Тео и Шаунак прокомментировали in situ ПЦР: «Несмотря на значительные усилия, этот метод все еще технически сложен и еще не доказал свою надежность или воспроизводимость». (19)

В исследовании, которое сравнивало результаты ПЦР с результатами теста на антитела, было обнаружено, что ПЦР не воспроизводится, и «ложноположительные и ложноотрицательные результаты наблюдались во всех лабораториях (соответствие с тестами на антитела варьировалось от 40% до 100%)». (20)

8. ПЦР возможен перекрестно заражаться

Незначительные количества нуклеиновых кислот из предыдущих образцов могут легко загрязнить тестируемый в настоящее время образец, давая ложноположительный результат. (21) Даже микроскопические кусочки кожи или волос лаборанта могут вызвать эту проблему. Существует множество источников перекрестного заражения, и оно может происходить «на любом этапе процедуры, от точки сбора образцов до окончательной амплификации …» (22)

Другие причины ложноположительных результатов перечислены Тео и Шаунаком: «Теперь мы определили ряд факторов, которые могут способствовать плохой амплификации целевой ДНК и генерированию ложноположительных сигналов. Эти факторы включают эффекты фиксации , отбор реагентов, деградация ДНК, мечение концов ДНК и диффузия продукта …. Мы считаем, что следует проявлять значительную осторожность при интерпретации результатов, полученных с помощью ПЦР in situ ». (19)

9. Часто возникают ложные положения при ПЦР.

• Профессиональное исследование для оценки эффективности ПЦР ВИЧ при обнаружении внеклеточной ДНК показало «тревожно высокий уровень неспецифической положительности» с использованием обычно используемых праймеров (SK38 / 39, для гена gag или p24). Фактически, одинаковые показатели положительности были обнаружены как для отрицательных, так и для положительных образцов (18% против 26%)! (23)
• Из 30 неинфицированных детей у 6 были «случайные» положительные результаты ПЦР. (24)
• ПЦР, проведенная на неинфицированных младенцах в возрасте до одного года, показала, что 9/113 (9 из 113), 15/143, 13/137, 7/87 и 1/63 младенцев имели положительные результаты ПЦР-тестов. (25)
• Из 117 неинфицированных детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, шесть (5%) имели ложноположительную ПЦР на пуповинную кровь. (26)
• В исследовании квалификации ПЦР 54% задействованных лабораторий имели проблемы с ложноположительными результатами; 9,3% от общего числа неинфицированных образцов были признаны положительными. (22)
• Один из 69 антител-отрицательных и не сероконвертеров был положительным по результатам ПЦР. (27)
• Лицо из группы высокого риска изначально было положительным при ПЦР, но отрицательным при повторном ПЦР-тестировании одного и того же образца в двух разных лабораториях. (27)
• Рабочая группа ПЦР Всемирной организации здравоохранения продемонстрировала высокий уровень ложноположительных результатов, полученных в ходе «слепых» исследований ПЦР на ВИЧ. (22)
• Sheppard et al. заявили в своем исследовании: «Это испытание продемонстрировало, что ложноположительные результаты, даже при строгих алгоритмах тестирования, происходят с достаточной частотой среди неинфицированных людей, чтобы оставаться незамеченной проблемой». (28)
• Из 327 медицинских работников, подвергшихся уколу иглой ВИЧ, у 4 был один или несколько положительных результатов ПЦР, а у 7 – неопределенные результаты. Более поздние образцы для всех 11 были отрицательными, и ни один из них не вызвал сероконверсии или развития антигенемии p24, что привело к выводу, что «ложноположительные результаты возникают даже при самых строгих условиях тестирования». (29)

Выводы

Существенным для теории доктора Хо является идея о том, что ВИЧ мутирует так быстро, что в течение нескольких дней или недель он становится устойчивым к любому «противовирусному» препарату, который принимает пациент. Чтобы предотвратить это, пациенту рекомендуется принимать «комбинации» из трех препаратов, которые теоретически поражают ВИЧ со всех сторон одновременно, что снижает вероятность выживания устойчивого штамма. Между тем, нужно постоянно следить за «вирусной нагрузкой» с помощью тестов, которые стоят 200 баксов за штуку. Особое внимание уделяется раннему вмешательству, то есть назначению пациентам нескольких препаратов сразу же после их сероконверсии (при условии, что кто-нибудь будет знать, когда это событие произошло с самого начала) и держать их на этих препаратах до конца своей жизни.

Несмотря на то, что никто не доказал, что они точны, тесты на вирусную нагрузку активно продвигаются как самые современные инструменты, необходимые для PWA, и нетрудно понять, почему. В Washington Post (2-06-96) Дэвид Браун непреднамеренно раскрыл причину: «Агрессивное лечение ВИЧ, вероятно, будет даже дороже, чем в прошлом. Измерение вирусной нагрузки будет стоить около 200 долларов за тест, а новое поколение ВИЧ лекарств, вероятно, будут как минимум такими же дорогими, как те, которые они заменяют».

US News and World Report (2-12-96) был более конкретным, оценивая годовую стоимость ингибитора протеазы примерно в 6000 долларов, а стоимость комбинаций из трех препаратов – от 12000 до 18000 долларов. Теперь назначаются комбинации из трех или четырех препаратов, тогда как раньше было достаточно одного (АЗТ). Поскольку все больше и больше лекарств считаются необходимыми для «лечения» людей, многие из которых не имеют с ними ничего плохого, очевидно, какой дойной коровой это станет для фармацевтической промышленности.

Теория вирусной нагрузки создала новое беспокойство, вызывающее невыносимый стресс в жизни отчаявшихся людей. Сейчас говорят, что у человека есть только одна инъекция новых «противовирусных» препаратов, в основном ингибиторов протеазы. Если вы не примете их точно в нужное время, в точно правильных комбинациях или количествах, или если вы по глупости принимаете только одно лекарство за раз, или снизите дозу, потому что текущая доза вызывает у вас заболевание, ваш вирус станет устойчив, и лекарства никогда больше на вас не подействуют. И вы не можете просто отказаться от лекарств по той же причине, даже если они вызывают у вас смертельную болезнь.

До сих пор в каждой статье на эту тему высказывались разные экспертные предположения о том, как должна работать вся эта программа: никто не знает, можно ли вылечиться или просто держаться на плаву. Никто не знает долгосрочного прогноза для тех, кто принимает эту тройную токсичную комбинацию. (Ингибиторы протеазы вызывают крайне неблагоприятные реакции у многих людей, поэтому понять это несложно). Любой, кто достаточно глуп, чтобы войти в это, станет подопытным кроликом для людей, которые не знают, что делают.

Когда мы перестанем позволять использовать себя в качестве подопытных кроликов для какой бы то ни было нелепой схемы? Когда мы заблокируем наши кошельки и откажемся платить за привилегию быть отравленными? И когда мы перестанем поддерживать самых деградировавших из существующих людей – тех, кто извлекает выгоду из страданий других?

Автор: Кристин Джонсон – член MENSA и независимый научный журналист из Лос-Анджелеса, США. Она является контактным лицом HEAL / Los Angeles, входит в совет консультантов журнала Continuum и является редактором журнала Reappraising AIDS. Она имеет обширный опыт в медицине, юриспруденции и библиотечных исследованиях, и ее движет желание узнать правду о «СПИДе». Она особенно заинтересована в том, чтобы сделать информацию в технических научных журналах доступной для общественности. В течение последних четырех лет она следила за работой пертской группы и писала статьи с критикой тестов на антитела к ВИЧ, включая обширное интервью с Элени Пападопулос-Элеопулос, которые были опубликованы во всем мире.

Источники

• 1. Embretson J, Zupancicl M, Ribas JL, et al. 1992. “Massive covert infection of helper T lymphocytes and macrophages by HIV during the incubation period of AIDS.” Nature. 362:359-362.
• 2. Pantaleo G, Graziosi C, Demarest J, et al. 1993. “HIV infection is active and progressive in lymphoid tissue during the clinically latent stage of disease.” Nature. 362:355-358.
• 3. Ho DD, Neumann AU, Perelson AS, et al. 1995. “Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection.” Nature. 373:123-126.
• 4. Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, et al. 1995. “Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection.” Nature. 373:117-122.
• 5. Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou J. 1995. “Turnover of HIV-1 and CD4 lymphocytes.” Reappraising AIDS. 3(6):2-4.
• 6. Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou J. Letter to Nature. 1994. “Is HIV really hiding in the Iymph nodes?”
• 7. Duesberg P, Bialy H. “Responding to ‘Duesberg and the new view of HIV”‘ in AIDS: Virus- or Drug-Induced. Kluwer Academic Publishers, Boston (1996).
• 8. Craddock M. 1995. “HIV: Science by Press Conference.” Reappraising AIDS. 3(5):-4.
• 9. Project Inform Fact Sheet: PCR Tests. August 1, 1995.
• 10. Duesberg P, Bialy H. 1995. “HIV an illusion.” Nature. 375:197.
• 11. Papadopulos-Eleopulos E, Turner VF and Papadimitriou JM. 1993. “Is a positive Western Blot proof of HIV infection?” Bio/Technology. 11:696-707.
• 12. Blattner WA. 1989. Retroviruses. pp545-592. In Viral Infections in Humans, third edition, edited by A Evans. Plenum Medical Book Company, New York.
• 13. Macy E, Adelman D. 1988. Letter to New England Journal of Medicine. December 15.
• 14. Sloand E, Pitt E, Chiarello R, et al. 1991. “HIV Testing: State of the art.” JAMA. 266:2861.
• 15. Maver, Robert. April 1993. “Testing AIDS Tests.” Rethinking AIDS. 1(4):4.
• 16. Centers for Disease Control Faxback document #320320, January 1993.
• 17. Eleopulos E, Turner VF, Papadimitriou J, Causer D. 1995. “Factor Vlll, HIV, and AIDS in hemophiliacs: An analysis of their relationship.” Genetica. 95(1-3):25-50.
• 18. Conway B. 1990. “Detection of HIV-1 by PCR in Clinical Specimens,” p40-45, in Techniques in HIV Research, edited by A Aldovini and BD Walker, MacMillan, New York.
• 19. Teo IA, Shaunak S. 1995. “PCR in situ: aspects which reduce amplification and generate false-positive results.” Histochem. J. 27:660.
• 20. Defer C, Agut H, Garbarg-Chenon A, et al. 1992. “Multicentre quality control of polymerase chain reaction for detection of HIV DNA.” AIDS. 6:659.
• 21. Bootman JS, Kitchin PA. 1994. “Reference preparations in the standardization of HIV-1 PCR: An international collaborative study.” J. Vir. Meth. 49:1-8.
• 22. Bootman JS, Kitchin PA. 1992. “An international collaborative study to assess a set of reference reagents for HIV-1 PCR.” J. Vir. Meth. 37:23.
• 23. Busch MP, Henrard DR, Hewlett IK, et al. 1992. “Poor sensitivity, specificity, and reproducibility of detection of HIV-1 DNA in serum by polymerase chain reaction.” J. AIDS. 5:872.
• 24. Garbarg-Chenon A, Segondy M, Conge A, et al. 1993. “Virus isolation, polymerase chain reaction and in vitro antibody production for the diagnosis of pediatric human immunodeficiency virus infection.” J. Vir. Methods. 42:117.
• 25. Paui MO, Tetali S, Lesser ML, et al. 1996. “Laboratory diagnosis of infection status in infants perinatally exposed to human immunodeficiency virus type 1.” J. Inf. Dis. 173:68.
• 26. Simonon A, Lepage P, Karita E, et al. 1994. “An assessment of the timing of mother-to-child transmission of human immunodeficiency virus type 1 by means of polymerase chain reaction.” J. AIDS. 7:952.
• 27. Celum CL, Coombs RW, Lafferty W, et al. 1991. “Indeterminate human immunodeficiency virus type 1 Western Blots: Seroconversion risk, specificity of supplemental tests, and an algorithm for evaluation.” J. Inf. Dis. 164:656.
• 28. Sheppard HW, Ascher MS, Busch MP, et al. 1991. “A multicenter proficiency trial of gene amplification (PCR) for the detection of HIV-1.” J. AIDS. 4:277.
• 29. Gerberding JL. 1994. “Incidence and prevalence of human immunodeficiency virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, and cytomegalovirus among health care personnel at risk for blood exposure: Final report from a longitudinal study.” J. Inf. Dis. 170:1410.